Telah dilakukan penelitian mengenai aktivitas antibakteri dari ekstrak batang biduri terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri dari ekstrak batang biduri terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dan mengetahui senyawa metabolit sekunder secara KLT-Bioautografi. Ekstraksi senyawa aktif menggunakan pelarut n-heksan, etil asetat, metanol, dan etanol dengan metode maserasi. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode sumur difusi agar. Dari hasil penelitian yang telah dilakukan menunjukan bahwa ekstrak etil asetat, metanol, dan etanol mempunyai aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji, sedangkan n-heksan tidak mempunyai aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji. serta diperoleh bahwa ekstrak etil asetat batang biduri mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi (kategori antibakteri kuat) terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dengan nilai diameter zona hambat masing-masing 18,42+ 0,12 mm dan 16,41± 0,08 mm. Berdasarkan pengujian KLT-Bioautografi ketiga ekstrak uji memiliki aktivitas antibakteri terhadap kedua bakteri uji. Pada ekstrak etil asetat dengan eluen etil asetat: n-heksan (7:3), ekstrak metanol dengan eluen klrofrom: metanol (9:1), dan ekstrak Etanol dengan eluen klrofrom : metanol (9:1), menggunakan pereaksi semprot AlCl3 dan FeCl3 1% diduga adanya senyawa Flavonoid dan tannin pada tiga ekstrak tersebut.

Kata kunci : Batang biduri (Calotrofis gigantea), Daya hambat, Antibakteri, KLT Bioautografi.