Fungi endofit merupakan suatu mikroorganisme yang ditemukan hidup di dalam jaringan tumbuhan. Kemampuan fungi endofit untuk memproduksi senyawa bioaktif merupakan peluang yang sangat menjanjikan dalam penyediaan bahan baku obat Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri yang dihasilkan jamur endofit isolat RB3 dengan fermentasi medium PDB dan CDB dan menentukan golongan senyawa metabolit sekunder isolat. Metode fermentasi goyang menggunakan rotary shaker incubator kecepatan 120 rpm selama 10 hari. Hasil fermentasi diekstraksi dengan etil asetat. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan menggunakan metode Kirby-bauer konsentrasi 5% pada media uji yang telah diinokulasikan bakteri Staphylococcus aureus dan Salmonella typhi yang dilanjutkan dengan KLT-Bioautografi pada isolat RB3 untuk menentukan zona hambat paling aktif dan mengidentifikasi senyawa. Hasil penelitian menunjukkan isolat RB3 yang difermentasi dengan medium CDB memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus dengan diameter 7.21 mm dan Salmonella typhi dengan diameter 8,67 mm. Senyawa hasil KLT-Bioautografi yang memberikan aktivitas antibakteri pada bakteri uji Salmonella typhi dan Staphylococcus aureus yaitu senyawa tanin pada Rf 0,52.

Kata kunci : antibakteri, isolat RB3, KLT Bioautografi, medium pdb dan cdb.