Selulase merupakan enzim kompleks yang terdiri dari endoglukanase, eksoglukanase dan glukosidase yang bekerja sama untuk menghidrolisis selulosa yang tidak larut menjadi glukosa. Enzim selulase dapat dihasilkan oleh mikroorganisme serta mempunyai karakteristik yang berbeda-beda, hal tersebut dipengaruhi oleh faktor lingkungan seperti suhu, pH, konsentrasi substrat dan waktu inkubasi. Enzim ini dapat digunakan dalam industri seperti pangan, deterjen tekstil, serat kayu dan kertas. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui determinasi aktivitas biokimia bakteri selulolitik serta karakterisasi enzim selulase dari bakteri asal kantong semar. Metode pengukuran aktivitas enzim yang digunakan adalah metode DNS (3,5 Asam Dinitro–Salisilat) dan pengukuran konsentrasi protein terlarut menggunakan metode Lowry. Dari hasil uji biokimia kelima isolat masuk kelompok Enterobacteriaceae, empat isolat dari genus Provindencia sp yaitu isolat BN1, BN2, BN3, BN4 dan satu isolat dari genus Morganella sp yaitu BN5. Kelima isolat tersebut memiliki nilai indeks selulolitik yang dihasilkan 0,62 – 1,17 mm; Aktivitas enzim selulase yang dihasilkan berkisar 0,088 – 0,566 U/ml; konsentrasi protein yang dihasilkan berkisar 0,413 – 1,661 mg/ml; Enzim selulase yang dihasilkan memiliki suhu optimum pada 38,9°C dengan pH optimum pada 7,7.

Kata kunci : Uji Biokimia, Karakterisasi Enzim, Selulase, Bakteri Selulolitik, Kantong Semar.